使用什么類型的儀器？

在質(zhì)譜分析中，對(duì)實(shí)驗(yàn)控制力是尤其重要的。一旦在周密的控制條件下得到離子，必須以適合的靈敏度將每個(gè)離子作為離散事件實(shí)施檢測。極少量的氣體載量使GC成為聯(lián)用技術(shù)早期理想的選擇，但僅僅適合20%的化合物分析。現(xiàn)今，我們在大多數(shù)情況下霧化LC洗脫液，將其作為質(zhì)譜儀中導(dǎo)入被測物實(shí)施電離的方法，該技術(shù)要求確保真空環(huán)境。

任何質(zhì)譜儀的一個(gè)重要設(shè)計(jì)元素是泵的容量。真空必須完全分布到儀器的所有稀薄大氣區(qū)域，并且泵容量必須充足，以滿足設(shè)計(jì)上的要求，比如離子入口的大小和需要去除蒸汽的量。

分析器：質(zhì)譜儀的心臟

分析器是分離或區(qū)分導(dǎo)入離子的儀器。在離子源可以形成正負(fù)離子，以及不帶電的中性粒子。但是，在指定時(shí)刻僅能記錄一種極性。現(xiàn)代的質(zhì)譜儀能夠在毫秒間轉(zhuǎn)換極性，得到高保真記錄，即使快速短暫事件，如典型的UPLC或GC分離中，峰僅僅大約1秒寬。

四極桿和扇形磁場

在1953年，西德物理科學(xué)家Wolfgang Paul和Helmut Steinwedel描述了四極桿質(zhì)譜儀。在4根平行桿之間，疊加的射頻（RF）和恒定的直流（DC）電勢能夠作為質(zhì)譜分離器，或過濾器，僅限于特點(diǎn)質(zhì)量范圍的離子，以恒定振幅振蕩，能夠在分析器上收集。現(xiàn)代儀器制造商將四極桿瞄準(zhǔn)到特定的應(yīng)用中。單四極桿質(zhì)譜儀要求基質(zhì)干凈，以避免無用離子的干擾，表現(xiàn)出非常好的靈敏度。

三重四極桿，或串聯(lián)四極桿（參見四極桿），是將一個(gè)四極桿加到另一個(gè)附加的四極桿上，四級(jí)桿串聯(lián)后能以各種方式發(fā)揮作用。一種途徑是通過離子獨(dú)有的質(zhì)荷比（m/z）分離并檢測復(fù)雜混合物中的目標(biāo)離子。證實(shí)串聯(lián)四極桿有效的另一途徑是當(dāng)與可控裂解分析聯(lián)用時(shí)。這些分析通常將目標(biāo)離子與其它分子（典型的氣體，如氬）進(jìn)行碰撞，母離子裂解成產(chǎn)物離子，MS/MS質(zhì)譜儀通過其獨(dú)特組成部分鑒別目標(biāo)化合物。

圖 6：當(dāng)設(shè)置過濾某一特定離子，那么其它質(zhì)量的離子則會(huì)以多種方式中丟失，比如撞擊到四極桿上，或直接偏離去檢測器的軌道。四級(jí)桿分析器由四根桿組成，通常平行排列，材質(zhì)為金屬，比如鉬合金。已投入

了大量的技術(shù)和研究，設(shè)計(jì)開發(fā)四極桿。按照離子在DC和RF場中的運(yùn)動(dòng)，將質(zhì)量分類。通過在軟件上改變參數(shù)，系統(tǒng)可改變場強(qiáng)，在任何指定時(shí)間內(nèi)，某一m/z值的離子被過濾掉，或通過四級(jí)桿到達(dá)檢測器。相比于一些質(zhì)譜儀的設(shè)計(jì)，比如飛行時(shí)間TOF質(zhì)譜儀（Tof），四極桿分辨率較低。而四極桿相對(duì)簡單，容易使用，是具有較高實(shí)用性的質(zhì)譜儀，能以相對(duì)低的成本提供各種接口。

在比較和說明MS的分析能力時(shí)，一些專業(yè)用語是必需的，在該入門指南的后續(xù)內(nèi)容中將會(huì)給出完整的定義：

分辨力（通常縮寫為"res"-質(zhì)譜儀分離兩種質(zhì)量的能力）：
- 低分辨力=單位質(zhì)量=1000
- 較高或中等分辨力=1000到10000
- 高分辨力=10000+
- 非常高的分辨力=高達(dá)3-5百萬Fragmentation

更詳細(xì)的分辨率檢查和我們怎樣測定分辨率將在"質(zhì)譜準(zhǔn)確性和分辨率"章節(jié)說明。"精確質(zhì)量"（Exact Mass）是化合物質(zhì)量的理論值，而準(zhǔn)確質(zhì)量（Accurate Mass）是化合物質(zhì)量的測量值，有相關(guān)的誤差范圍，比如5ppm。準(zhǔn)確質(zhì)量也經(jīng)常用于針對(duì)具體的技術(shù)，而不是測得的質(zhì)量。MS/MS - 描述了監(jiān)測前體離子或碎片向產(chǎn)物離子轉(zhuǎn)變的多種實(shí)驗(yàn)（多反應(yīng)監(jiān)測[MRM]和單反應(yīng)監(jiān)測[SRM]），總的趨勢是在一臺(tái)儀器上提高檢測的選擇性、專一性或靈敏度。即前后兩個(gè)質(zhì)量分析器，兩極質(zhì)譜分析在一臺(tái)質(zhì)譜儀器中實(shí)現(xiàn)。在三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀中有3套四級(jí)桿過濾器，但是僅有第1和第3套四極桿用作質(zhì)量分析器。近來的設(shè)計(jì)完全將中間設(shè)備區(qū)分開（取代早期設(shè)計(jì)的四極桿），增加了更多的功能，通常將其改稱為串聯(lián)四極桿。第一套四極桿（Q1），作為質(zhì)量過濾器，傳輸并加速選定離子，將其送向Q2（被稱為碰撞室）。雖然在一些設(shè)計(jì)中，Q2類似于其它兩套四極桿，RF施加在桿上的作用僅是傳輸，而不是質(zhì)量選擇。Q2中的壓力較高，離子在碰撞室內(nèi)與中性氣體相碰撞。結(jié)果經(jīng)CID發(fā)生裂解。碎片隨后加速進(jìn)入Q3，另一個(gè)質(zhì)量過濾器，離子被排列后，進(jìn)入檢測器。

裂解CID也稱為碰撞激活解離（CAD），為一種裂解機(jī)制，通過該機(jī)制在氣相中，分子離子裂解，通常在真空區(qū)域經(jīng)電勢加速到高動(dòng)能，接著與中性氣體分子碰撞，比如氦、氮或氬。部分動(dòng)能通過碰撞而轉(zhuǎn)化（或內(nèi)化），這引起化學(xué)鍵的斷裂，分子離子減小形成較小的碎片。一些類似的‘特別目的'的裂解方法，包括電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）和電子捕獲解離（ECD）。

圖 7：硫丹-β產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。237Da的前體離子從左邊進(jìn)入，在MS/MS碰撞室內(nèi)裂解。關(guān)于MS譜的全掃描，數(shù)據(jù)系統(tǒng)僅能夠顯示目標(biāo)碎片（不是得到的所有碎片），得到相對(duì)簡單的圖譜。您能控制破碎的限度，因此您能選擇前體離子。

圖 8：MRM響應(yīng)（左）和SIR響應(yīng)（右）的比較圖表明，由于基質(zhì)的化學(xué)背景，被測物即使在溶液中，也不能由SIR數(shù)據(jù)確定被測物峰。使用相同的GC/MS/MS質(zhì)譜儀，選擇m/z=146的丁基化離子作為前體離子，裂解該離子，得到產(chǎn)物離子（顯示為57m/z），定量鑒別它的存在。在一些控制工業(yè)中，為了滿足陽性化合物的鑒別要求，每個(gè)MRM計(jì)為1.5"鑒別點(diǎn)"，而每個(gè)SIR計(jì)為1.0。因此，為滿足選擇性要求，得到3"IPS"，每個(gè)化合物您需要2個(gè)MRM轉(zhuǎn)換，或3個(gè)SIR。扇形磁場，或扇形磁場質(zhì)量分析器，是早期儀器，一直用到現(xiàn)今，盡管用的較少（已被現(xiàn)代的能以ESI電離模式工作的質(zhì)譜儀取代，）。例如，Waters AutoSpec^TM，廣泛用于極端高靈敏度的二英分析。

扇形磁場彎曲成弧形離子軌道。離子的"動(dòng)能與電荷"比率決定了軌道的半徑，可通過電或磁場測定。較大m/z的離子比較小m/z通過的軌道路徑長。通過改變磁場強(qiáng)度，可控制軌道路徑。雙聚焦質(zhì)譜儀可按各種組合方式，將磁場和電場結(jié)合起來，但扇形電場后接磁場更常見。兩種場最初聯(lián)用時(shí)，按照離子流出離子源的動(dòng)能采用扇形電場聚焦離子。角度聚焦之前的能量聚焦，使相同質(zhì)量，但分子式不同的離子實(shí)現(xiàn)分離。離子阱和其它非掃描質(zhì)譜儀離子阱質(zhì)譜儀的原理類似于四極桿質(zhì)譜儀。不同于過濾式的四極桿質(zhì)譜儀，離子阱和功能更強(qiáng)的離子回旋(ICR)質(zhì)譜儀一樣，將離子存儲(chǔ)在三維空間中。在飽和之前，離子阱或回旋加速器將選定離子射出以進(jìn)行檢測。在離子阱范圍內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)一系列實(shí)驗(yàn)分析，裂解目標(biāo)離子，通過形成的碎片，以準(zhǔn)確的確定前體離子。RF電壓產(chǎn)生的電場作用于排列成"三明治"幾何構(gòu)形（端蓋相對(duì)的端蓋電極）離子阱的兩電極之間的空間。掃描RF電壓，改變某離子的固有頻率使其逸出。有時(shí)動(dòng)態(tài)范圍不寬。離子阱對(duì)捕獲存儲(chǔ)離子的有限體積和容量，限制了該種質(zhì)譜的使用范圍，尤其對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中的樣品。離子阱質(zhì)譜儀于1980年推出，但是早期這類質(zhì)譜儀采用內(nèi)部電離，具有一定的局限性，限制了其在很多領(lǐng)域的應(yīng)用。僅當(dāng)出現(xiàn)外部電離技術(shù)后，這類質(zhì)譜儀才得到了越來越廣泛的使用。多級(jí)碎裂的能力，從一個(gè)被測物中可衍生出更多結(jié)構(gòu)信息（即，碎裂-碎片離子-選擇-特定片段-碎裂，并重復(fù)這一過程）被稱為MSn。GC色譜峰不夠?qū)挘辉食^一個(gè)碎裂過程的進(jìn)行（MS/MS或MS²）。離子阱質(zhì)譜儀的MS/MS分析或裂解是根據(jù)時(shí)間，而不是空間，與四極桿和扇形磁場相同。因此，離子阱不能用于某些MS/MS分析，比如中性丟失和前體離子的比較。而且，在離子阱質(zhì)譜儀的MS/MS圖譜中，低質(zhì)量端約1/3母離子m/z的碎片離子丟失，這是離子阱設(shè)計(jì)本身造成的結(jié)果。為了抵消這一損失，一些制造商通過軟件加寬掃描要求彌補(bǔ)了這一損失。加寬掃描要求在數(shù)據(jù)采集時(shí)轉(zhuǎn)換工作參數(shù)。

離子阱的設(shè)計(jì)設(shè)置了前體質(zhì)荷比（m/z）和最低俘獲碎片離子之間的比率上限，通常稱為"三分之一規(guī)則"。例如，一個(gè)m/z1500的母離子，其m/z500以下的碎片離子檢測不到，這大大限制了多肽的人工測序分析。當(dāng)太多離子進(jìn)入離子阱的空間，由于空間電荷效應(yīng)，動(dòng)態(tài)范圍受到限制。制造商已經(jīng)開發(fā)了自動(dòng)掃描技術(shù)，在離子進(jìn)入離子阱之前，能夠?qū)﹄x子進(jìn)行計(jì)數(shù)，或門控制允許離子進(jìn)入的數(shù)量。在大量背景離子共存目標(biāo)離子很少時(shí)，仍然會(huì)遇到困難。因?yàn)楣δ茉O(shè)計(jì)類似，雜交型串聯(lián)質(zhì)譜儀吸收了四極桿和離子阱兩方面的長處，提高了靈敏度，并可以進(jìn)行快速實(shí)驗(yàn)分析，實(shí)現(xiàn)兩種質(zhì)譜儀單獨(dú)使用不能實(shí)現(xiàn)的功能。這種質(zhì)譜儀有時(shí)稱為線性離子肼（或Q-TRAPs）。線性離子阱質(zhì)譜儀離子阱體積的增加（與三維離子阱相比），提高了動(dòng)態(tài)的范圍。離子阱質(zhì)譜儀不能像四極桿質(zhì)譜儀那樣掃描，因此使用單離子監(jiān)測（SIM）或單離子記錄（SIR）技術(shù)不能像四極桿和扇形質(zhì)譜儀那樣提高離子阱的靈敏度。快速傅里葉變換離子回旋加速器（FTICR）具有極高的質(zhì)量測量能力，能夠分辨緊密靠近的質(zhì)量。雖然對(duì)大多數(shù)應(yīng)用還不可行，但是14.5特斯拉的磁場能夠取得超過350萬的分辨率，因此能夠區(qū)分質(zhì)量相差小于單個(gè)電子質(zhì)量的化合物。回旋加速器采用恒定磁場，通過靜電平衡作用捕獲離子。RF電壓脈沖引起軌道離子運(yùn)動(dòng)，然后，在軌道上運(yùn)動(dòng)的離子在捕獲單元的檢測板上產(chǎn)生一微弱信號(hào)（離子軌道頻率）。該頻率與離子的m/z成反比，信號(hào)強(qiáng)度與單元中該m/z離子的數(shù)量成比例。在非常低的氣壓下，回旋加速器能夠保持恒定的離子軌道，這樣在長時(shí)間里，都能夠進(jìn)行超高分辨率的測量。持續(xù)非共振，輻射（SORI）是在傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜技術(shù)中使用的CID技術(shù)。在回旋加速運(yùn)動(dòng)中壓力增加，離子被加速，引起碰撞，得到離子碎片。離子裂解后，壓力減小，恢復(fù)高真空，以分析碎片離子。

TOF質(zhì)譜儀已開發(fā)多年，因其快速、準(zhǔn)確的電子組件和現(xiàn)代的電離技術(shù)（如ESI），已成為很多現(xiàn)代研究工作的基礎(chǔ)。TOF質(zhì)譜儀能提供準(zhǔn)確的質(zhì)量測量，誤差范圍是分子真實(shí)質(zhì)量的幾個(gè)ppm。TOF質(zhì)譜儀為時(shí)間分散質(zhì)量分析儀，使用時(shí)以線性方式，或需靜電網(wǎng)格和透鏡（作為反射板）的輔助。當(dāng)以反射式操作時(shí)，分辨率增加，且無靈敏度的顯著損失，或不需要增加飛行管（或漂移管）的大小。

TOF分析通過脈沖加速一組離子到達(dá)檢測器。離開離子源后，每個(gè)離子從"推進(jìn)"電得到一個(gè)相同的電荷或電勢，離子被加速射進(jìn)超低壓管。因?yàn)樗袔ь愃齐姾傻碾x子具有相同的動(dòng)能（動(dòng)能=mv2，m為離子質(zhì)量，v是速度），在撞擊到檢測器前，較低質(zhì)量的離子具有較高的速度和更小的間隔。因?yàn)橘|(zhì)量、電荷和動(dòng)能決定了離子到達(dá)檢測器的時(shí)間，離子的速度可表示為v=d/t=（2KE/m）1/2。離子通過指定的距離（d）的時(shí)間（t）取決于質(zhì)荷比（m/z）。因?yàn)槊看?"電壓推動(dòng)"后，TOF測量的是所有質(zhì)量數(shù)，所有相對(duì)于掃描型質(zhì)譜儀，TOF質(zhì)譜儀可得到非常高的靈敏度。如今，四極桿MS系統(tǒng)常規(guī)掃描速度為每秒10000Da（或原子質(zhì)量單位）。因此一次全掃描，即使持續(xù)時(shí)間短的一次掃描（例如，1秒鐘的LC或GC峰），在每秒內(nèi)捕獲每個(gè)離子的次數(shù)達(dá)不到10次或更多。TOF質(zhì)譜儀檢測器記錄離子轟擊檢測板的數(shù)目，轟擊彼此間隔時(shí)間為納秒級(jí)。當(dāng)直接與掃描質(zhì)譜儀（比如四極桿）相比較，TOF的分辨率擴(kuò)寬了動(dòng)態(tài)范圍，提供更高的分辨率。總的來說，當(dāng)檢測復(fù)雜混合物中的目標(biāo)被測物時(shí)，四極桿類的儀器更靈敏感，通常是更好的定量工具。一些儀器，像離子阱，具有組合功能，但直到雜交型質(zhì)譜儀出現(xiàn)前，沒有單個(gè)質(zhì)譜儀表現(xiàn)出全方位的高效性能。早期的MALDI-TOF的設(shè)計(jì)加快了離子離開離子源。該技術(shù)分辨率相對(duì)低，準(zhǔn)確性有限。延遲提取技術(shù)（DE）是為MALDI-TOF質(zhì)譜儀開發(fā)的一項(xiàng)技術(shù)，在離子形成后，加速離子在進(jìn)入飛行管之前冷卻"并聚焦離子大約150納秒。與未冷卻的離子相比，冷卻的離子具有較低的動(dòng)能分布，當(dāng)冷卻離子進(jìn)入TOF分析器時(shí)，降低離子時(shí)間展寬，結(jié)果增加了分辨率和準(zhǔn)確度。DE對(duì)大分子成效不顯著（例如，蛋白質(zhì)>30000Da）。

圖 10：適合的指定條件下（比如，無基質(zhì)干擾)，當(dāng)選擇掃描模式工作時(shí)，TOF比串聯(lián)四極桿的靈敏度高很多倍，因?yàn)門OF不用‘掃描'，不會(huì)犧牲"占空比"。

雜交

"雜交"適用于各種質(zhì)譜儀設(shè)計(jì)，雜交技術(shù)是現(xiàn)存技術(shù)的集成，比如雙聚焦、扇形磁場和近來的"前端"回旋加速的離子阱。十分值得注意的一種雜交方式是四極桿飛行時(shí)間（QTOF）質(zhì)譜儀，將TOF質(zhì)譜儀和四極桿質(zhì)譜儀組合在一起。這種是幾種性能特征的理想組合：準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測、裂解分析的功能以及高質(zhì)量的定量分析。

 

 

圖 11：具有TriWave的SYNAPT 高性能質(zhì)譜儀。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，產(chǎn)生了離子遷移率測量和分離相結(jié)合的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)技術(shù)。離子遷移率質(zhì)譜法（或IMMS法，通常縮寫為‘IMS'）是基于多種因素的組合來區(qū)分離子的技術(shù)，這些因素包括：離子大小、形狀、電荷和質(zhì)量。IMMS通常在機(jī)場和手持領(lǐng)域的元件中使用，可對(duì)遷移率已知的小分子實(shí)現(xiàn)快速（20毫秒）檢測：例如某些毒品和炸藥的檢測。當(dāng)采用更高位的質(zhì)譜儀，IMMS提供正交分離（對(duì)LC和MS），以及一些獨(dú)特功能，包括：

- 分離異構(gòu)體、同重化合物和構(gòu)象異構(gòu)體（從蛋白質(zhì)到小分子），測定其平均轉(zhuǎn)動(dòng)碰撞橫截面。
- 增強(qiáng)復(fù)雜化合物的分離（通過MS或LC/MS），引起峰容量增加和樣品清潔度的增加（離子的物理分離，尤其是化學(xué)噪音和干擾目標(biāo)分析物的離子）。
- 在結(jié)構(gòu)分析研究中，通過CID/IMMS、IMMS/CID或CID/IMMS/CID等性能獲得更多有用信息。

在所有的3個(gè)分析方案中，高效離子遷移率和串聯(lián)質(zhì)譜法的組合有助于克服分析中存在的問題，其它分析方法，包括傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析法或液相色譜測試設(shè)備，可能也無法解決這些現(xiàn)存的問題。

在本章結(jié)尾引用了H.H.Hill Jr.等人的評(píng)論文章，比較了各種類型的離子遷移率（到文章2007年出版時(shí)，可用到的質(zhì)譜儀），并描述了對(duì)各種被測物應(yīng)用離子遷移率的益處。目前在質(zhì)譜分析中，應(yīng)用的4種離子遷移率分離方法：
- 漂移時(shí)間離子遷移率質(zhì)譜法（DTIMS）
- 吸入離子遷移率質(zhì)譜法（AIMS）
- 差異遷移率質(zhì)譜法（DMS），也稱為不對(duì)稱場波形離子遷移率質(zhì)譜（FAIMS）
- 行波離子遷移率質(zhì)譜（TWIMS）

按照作者的觀點(diǎn)，"DTIMS能提供更高的IMS分辨力，它是僅有的（IMMS）能夠直接測量截面碰撞的方法。AIMS是低分辨的遷移率分離方法，但是它只能連續(xù)監(jiān)測離子。DMS和FAIMS具有連續(xù)的離子監(jiān)測能力，以及正交離子遷移率分離的功能，能夠?qū)崿F(xiàn)高分離選擇性。TWIMS是一種新（IMMS）方法，其分辨能力相對(duì)低，但具有較好的靈敏度，能很好地與商品化的質(zhì)譜儀工作結(jié)合。"

圖 12：用彩球表示的，不同遷移率的無差異離子被俘獲、累積，然后釋放到T-波離子遷移率分離（IMS)裝置中。

 

圖 13：一旦釋放進(jìn)入T-波區(qū)域，行波波形驅(qū)動(dòng)離子通過中性緩沖氣（通常是0.5毫巴的氮?dú)猓凑针x子遷移率分離離子。

 

離子遷移與MS聯(lián)用，也應(yīng)用在生物分子氣相結(jié)構(gòu)的研究。Pringle等（在此引用）應(yīng)用雜交型四極桿-行波離子遷移分離器-正交加速TOF質(zhì)譜儀，考察了一些肽和蛋白離子的遷移率分離。將從行波（TWIMS）分離設(shè)備上獲取的離子遷移率數(shù)據(jù)與使用其它類型遷移率分離器獲取的數(shù)據(jù)比較表明："當(dāng)遷移率特點(diǎn)類似時(shí)，新的雜交技術(shù)的質(zhì)譜儀提供的遷移率分離不影響質(zhì)譜儀的基本靈敏度。該功能在顯著分析水平上有利于樣品遷移率的研究。"